Western blot成像方法取決于二抗的標(biāo)記物，常用的方法有基于酶促反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光法，基于熒光染料的可見熒光方法和紅外熒光方法，那么我們應(yīng)該如何選擇呢？
*合適的Western blot實驗方法取決于您期望獲得哪些信息，也就是取決于您的實驗?zāi)康模【幈容^了現(xiàn)有方法的優(yōu)缺點，并分享了自己的心得，希望能夠幫助您選擇到*佳的實驗方法。
化學(xué)發(fā)光方法
化學(xué)發(fā)光western blot是相對容易且靈敏度*的檢測方法，靈敏度可以達(dá)到fg級。
適用于研究：通過電泳可輕松分離的分子量差異顯著的蛋白。
> 檢測單一蛋白
> 確定蛋白有無
> 檢測抗體反應(yīng)
> 蛋白純度分析
> 檢測低豐度蛋白
| 優(yōu)勢 | 劣勢 |
| 靈敏度高 | 半定量 |
| 實驗流程熟悉 | 酶促反應(yīng) |
| 兼容膠片和數(shù)字成像系統(tǒng) | 一次只能檢測單一信號 |
| 需要玻璃和重孵育 | |
| 膠片沒有過飽和提醒 |
熒光檢測方法
熒光染料分為可見熒光染料和紅外熒光染料，從而將熒光western blot檢測分為可見熒光檢測和紅外熒光檢測。目前可見熒光檢測*多三個通道，可以同時檢測三種不同的蛋白，近紅外檢測*多為兩個通道，一定選擇激光光源激發(fā)的哦，更接近近紅外染料的*大發(fā)射波長680nm和800nm，增強二抗信號，提高檢測的靈敏度。
熒光Western blot使用熒光染料標(biāo)記的二抗進行檢測，膜上的靶標(biāo)蛋白濃度與可見熒光信號強度呈線性關(guān)系，實現(xiàn)真實可靠的定量分析。熒光染料發(fā)射光譜不同，因此在一張印跡膜上可實現(xiàn)多重檢測。在無需剝離和重孵育條件下，進行上樣量質(zhì)控，可以分析翻譯后修飾蛋白。
因此當(dāng)您進行如下實驗室，選擇熒光檢測方法，妥妥的：
> 同時檢測多種蛋白
> 研究翻譯后修飾蛋白
> 同一印跡膜的上樣質(zhì)控
> **定量western blot實驗
| 優(yōu)勢 | 劣勢 |
| 可進行多重檢測 | 膜會有自發(fā)熒光 |
| 定量 | |
| 信號持久穩(wěn)定 | |
| 實驗方法不需改變太多 |
期刊雜志要求：
例如nature中“Image Integrity and Standards”中鼓勵在一張印跡膜上進行內(nèi)參和目的蛋白的的檢測，同時使用合理的標(biāo)準(zhǔn)化方法：例如：全蛋白歸一化。
化學(xué)發(fā)光屬于酶促反應(yīng)，動態(tài)范圍窄，只能實現(xiàn)定性分析，一次只能檢測一個信號，如要檢測多個信號，需要剝離和重孵育，如使用膠片成像，還需要反復(fù)摸索曝光時間，顯影定影設(shè)備和設(shè)備的維護，熒光檢測可同時滿足期刊雜志發(fā)表要求、一次可進行多個信號檢測，反應(yīng)條件一致，jingzhun定量，特別近紅外熒光檢測方法，具有低背景，高信噪比，是現(xiàn)在western blot熒光定量的金標(biāo)準(zhǔn)。
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